詳細分析了植物組織培養污染的種類及其發生的原因：污染的種類有細菌和真菌，真菌污染主要來源于環境，細菌污染主要來源于接種材料、接種工具、接種無菌操作過程不規范等。由此提出了做好培養基消毒、環境清潔衛生等日常工作流程、接種過程嚴格按無菌操作、無菌材料的及時更新等防控措施，以期將污染率控制在合理低范圍內。

　　1 引言

　　由于植物組培繁殖育苗周期短、可以大批量生產、成本低、可控性強，能為商品林(如桉樹)及花卉工廠化育苗方面做出很大貢獻。但在組培工廠化育苗的日常生產中，污染問題難以回避，而且污染率的增加必然提高生產成本，在市場競爭中，如何降低經濟成本提高經濟效益是工廠化育苗的首要問題，因此防治污染是組培育苗中不可忽視的技術環節[1]。筆者以林科所的組培廠為實例，在分析植物組織培養過程中產生污染的原因及其性狀的基礎上，提出了防治措施，為植物工廠化育苗提供技術參考。

　　2 組培污染的原因及防控措施

　　植物組培是在無菌條件下進行的，若有微生物進入培養瓶中，引起污染，組織培養將無法進行。污染主要是真菌、細菌引起的。真菌在培養條件下生長快，很容易觀察到，一般在接種3～5 d后出現，主要癥狀是培養基表面或材料附近出現絨毛狀菌絲，然后形成不同顏色的孢子層，黑色、白色和黃色的孢子層較多見。孢子層從培養基表面長起，逐漸沿著瓶身長到瓶蓋，甚至漫延到瓶外。孢子在空氣中擴散，對培養室造成嚴重污染。所以發現受到真菌污染的瓶苗，要即時清除出培養室，防止其變成一個污染源，引起其它瓶苗污染。真菌污染主要是由于培養室和接種室的空氣受污染或者室內環境不衛生造成，它的重要特點是發展迅速、難控制。

　　細菌潛伏期長，很難在前期肉眼觀察到，一般5～10 d后，會在培養基表面、材料附近或在培養基里面形成(多見白色、黃色)黏液狀菌斑、鼻涕狀或絲狀的菌落，混濁水跡并伴有發酵狀泡沫。其原因是由于使用了未消毒完全的工具引起，也可能是操作人員呼吸排出的氣體中帶細菌或培養材料帶細菌等。

　　植物組培污染的控制取決于滅菌技術、滅菌設備、組培材料的繼代時間、無菌操種過程和環境條件等許多方面[3，4]。污染有霉菌、黃單胞菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、棒狀桿菌屬、歐文氏菌屬等。真菌污染主要是霉菌來源于環境，細菌污染主要來源于接種材料、接種工具、接種無菌操作過程不規范等，因此污染可通過如下措施克服：接種室與培養室要定期做好消毒與凈化，保持清潔干凈，定期進行熏蒸或用70%酒精、新潔爾噴霧消毒。在夏季，在高濕高溫的天氣條件下、或其他有利于真菌繁殖傳播時，建議用甲醛(甲醛用量4～6 mL/m3+高錳酸鉀用量3～6 mL/m3)熏蒸培養室殺菌，甲醛消毒效果好，但甲醛對瓶苗和人體都有一定的傷害，甲醛在滅菌過程中會對瓶苗造成一定的傷害，造成組培苗生長緩慢甚至少部分干枯[5]，所以在瓶苗生產高峰期不用或少用甲醛消毒。在桉樹生產淡季而且是真菌污染較嚴重時進行甲醛消毒。這樣既保證降低污染的同時也不會影響瓶苗的出貨量和質量。

　　在桉樹生產淡季(主要是夏季)降溫消耗電能很多，同時也易污染，所以夏季應減少生產量，以保種為主[6]。此時真菌污染比較嚴重可進行甲醛消毒。此外，濕度太高，可以用抽濕機除濕，應使培養室的空氣相對濕度控制在70%左右。組培廠降溫用的空調也有除濕功能，但在春夏季的多雨天氣中，其除濕效果遠遠未夠，所以使用抽濕機效果更好，而且從生產成本來說，抽濕機除濕的費用相對空調低。

　　秋季和冬季濕度漸漸降低，溫度也漸漸下降，組培苗污染率也相應下降。真菌污染大大地減少，培養室內空氣含菌量較少，因甲醛對瓶苗和人體都有一定的傷害，所以不用或少用甲醛消毒。平時培養室和接種室一定要保持干凈清潔，下班后和上班前采用紫外燈照射培養室和接種室30 min消毒，臭氧消毒對環境效果較好，使用方便，對人體傷害小。關紫外燈后，工作人員不能立即進入室內，要打開抽風機20～30 min后再工作，防止紫外線輻射對人體造成傷害。常用70%的酒精、新潔爾噴灑培養室和接種室，進行室內消毒，使空氣中真菌孢子、細菌沉降，重點噴灑培養架和培養瓶表面，用新潔爾擦洗培養室地面和門窗。

　　接種用的超凈工作臺(超凈工作臺內的潔凈度應該為100級)要定期檢查(如定期對風機過濾網清洗衣更換，每隔一段時間檢測操作區的帶菌量，如發現過濾網工作失敗，要整個更換。此外，還需要測定操作區的風速，通過調壓旋鈕使操作區的網速達到無菌操作需要的標準)，在使用超凈臺前開啟通風裝置并打開工作臺紫外燈照射20～30 min，任何進入超凈臺的非無菌物件都要噴灑70%酒精消毒，培養瓶的瓶口位置用70%酒精重點擦拭。操作時戴一次性膠手套且接種前用70%酒精噴灑消毒、戴帽子(防止頭發的灰塵對接種過程中造成污染)、戴口罩(防止呼吸中氣流帶菌對接種過程中造成污染)、穿著接種專用的工作鞋和工作服。接種人員應嚴格執行無菌操作，對接種中所需的工具，如碟子要經高溫高壓消毒，鑷子和接種刀在每用一次后都要先用70%酒精擦拭，再放入120 ℃高溫消毒器中消毒(特別在不小心接觸到污染物時，極易由于接種器具引起二次污染)，待自然涼冷后再接種，防止接種器械太熱會對接種材料造成熱傷害，影響生長。接種時要在工作臺的操作區域內，工作臺內不要擺入過多待用材料，避免工作臺內凈化氣流被擋住，嚴格檢查接種材料，舍棄被真菌和細菌污染的材料(一般真菌明顯可見，細菌特別是培養基里面的呈白色濃狀的細菌不易發現，在光線充足下要仔細才能認出，易被接種手忽略，經接種后造成繼代分再污染，要對接種手辨認細菌進行嚴格訓練)。接種中途不要將培養基、接種工具等拿入，破壞超凈臺的無菌環境。

　　經常檢查消毒鍋的滅菌質量，如嚴格按消毒規程操作后仍有污染現象，特別是在短時間內出現大批量的污染苗時(除考慮環境、氣候外，消毒鍋滅菌質量也是一個重要考慮因素)，應及時檢查滅菌鍋的性能，若發現問題立即修復。培養基需要在高壓而且在121～123 ℃條件下滅菌20～30 min，若滅菌時間或滅菌溫度、壓力不夠，培養一段時間后就會在培養基表面產生污染，所以要嚴格按操作規程進行。

　　對于被污染物件的處理：在春、夏季真菌污染嚴重時，被污染的瓶苗須高溫高壓消毒滅菌再清洗，如果直接清洗，瓶內的孢子等污染物擴散到空氣中，造成二次污染。對于其他被污染的器械也要單獨清洗，有條件的要高溫高壓滅菌后再使用。

　　檢查培養瓶蓋是否存在問題。培養瓶封口多用塑料蓋，塑料蓋用久了易老化，密封性差，空氣中真菌、細菌會進入到瓶內造成污染，特別是在真菌污染嚴重季節更需要特別注意這個問題。當發現培養瓶蓋存在問題時，應及時更換。

　　桉樹初代培養或前幾代培養中存在污染，并不形成明顯菌落而只在培養基內部形成“絲狀物”、“暈狀物”，肉眼觀測不易發現，隨著時間過長，材料的健康狀況不斷惡化，造成材料自帶內生菌，也是造成污染的一個重要原因。這種情況下可以通過在培養基中添加抗菌素抑制內生菌，但很多抗菌素一般不耐高溫，需要采用過濾滅菌。在工廠化育苗生產過程中添加起來不方便。而且針對不同的植物品種要想找到一種合適的抗生素處理組合是較困難的，工作也相對繁瑣，沒有一種抗生素對所有的細菌都有效，即使有效，抗生素消除植物組培污染的方法也只是暫時的解決方法，如果長期使用抗生素消除污染，必然對組培苗的生長、分化、生根造成一定的影響。因此，還可以通過對材料的更新來避免污染，通過采伐外植體，進行外植體誘導分化叢生芽得到新的無菌材料，這樣得到的無菌材料形態性狀最穩定。但耗時長工作量大，應在生產淡季就作無菌材料準備，這樣就可以防止在生產中出現分化材料斷檔情況。

　　植物組培污染種類雖然多種多樣，但只要針對不同的污染情況，做好防控措施，如接種過程嚴格按無菌操作;培養基和接種器械的消毒在規定的時間內高溫高壓消毒;室內環境清潔衛生等日常工作流程嚴格按規程做好;在生產淡季可以通過做外植體獲得新的無菌材料，既使分化材料得到更新，又為生產旺季繼代材料作好準備等，這樣可以將污染控制在合理的低范圍內。

相關文章：