蒜頭果Malania oleifera為鐵青樹科Olacaceae蒜頭果屬常綠喬木，為我國特有的二級保護植物，2013年被列為極小種群野生植物物種，目前僅有 1.5萬余株野生植株零星分布于我國云南與廣西的狹長區域。蒜頭果果實富含油脂，其中神經酸(二十四碳烯-15-酸)相對含量高達 67%。神經酸可促進神經細胞發育和生長，并對改善記憶、心血管疾病、抗疲勞、防止神經衰弱等具有良好的藥理功效，是倍受青睞的保健品添加劑，同時是合成麝香酮的理想原料(麝香酮是天然麝香的主要成分且含量僅為2%)，具有較好的產業開發價值。

　　植物組織培養技術對挽救蒜頭果處境及產業化開發具有重要意義。目前，對蒜頭果的組織培養已有報道，但有關褐化現象的研究少見報道。本研究利用正交試驗設計，分析蒜頭果組培中的褐化問題，并對其褐化控制措施進行探討。

　　1　材料與方法

　　1.1　材料

　　蒜頭果外植體來源于云南山里紅生物科技有限公司種質資源圃(廣南)，為3～5年生實生苗。

　　1.2　方法

　　采集枝條作為外植體，去除葉片保留葉柄，裁成所需的材料類型(詳見1.3)，然后流水沖洗1 h，再用洗潔精搖晃清洗5 min，在超凈臺上消毒，無菌水充分清洗，無菌濾紙吸干。切除0.5 cm傷口，將材料切為含1～2個腋芽的兩段，莖段長1.5～2 cm，接種至培養基，每瓶接種1個莖段，每處理30瓶。培養條件光照 2000～3000 lx，光照周期8 h·d-1，溫度(25±2) ℃。培養至第7 天觀察外植體褐化情況，并計算褐化率和獲得率，褐化率為褐化株數占接種總數百分比，獲得率為未污染未褐化株數占接種總數百分比。采用SPSS 21.0進行數據分析。

　　1.3　L9正交試驗設計

　　1.3.1　消毒方式 設三種消毒方式：75%乙醇處理30 s，再用0.1%升汞(HgCl2)處理10 min;2%次氯酸鈉(NaClO)處理15 min;0.1% HgCl2處理6 min+2% NaClO處理10 min (表1)。

　　1.3.2　外植體 6月下旬至7月上旬，取長8～12 cm腋芽飽滿的當年春季新梢，裁為三段，每段含腋芽2～4個，長3～4 cm，分為莖梢、幼嫩、半木質化三種類型進行正交試驗。

　　1.3.3　抗氧化劑　培養基中分別按添加2 g·L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、添加200 mg·L-1抗壞血酸(VC)和添加300 mg·L-1硫代硫酸鈉(Na2S2O3)三種抗氧化劑安排正交試驗。除添加抗壞血酸的培養基采用過濾滅菌，其他均為高壓蒸汽滅菌。

　　1.3.4　培養基 分 3種基本培養基安排正交設計，分別為 1/2MS、1/2WPM、1/2DKW。培養基均添加2.0 mg·L-1 6-BA、0.1 mg·L-1 NAA、糖 30 g·L-1、瓊脂 6 g·L-1、活性炭 1 g·L-1，pH=5.5。

　　表1　正交試驗設計因素與水平

　　

 

　　2　結果與分析

　　2.1　正交試驗分析

　　由表2可知，極差R依次為B>C>A>D，即影響蒜頭果外植體褐化的因素按主次排序為外植體>抗氧化劑>消毒方式>培養基;各因素最優水平組合為A3B3C1D1，即采用當年生靠近新梢末端半木質化部位作為外植體，通過0.1%升汞6 min + 2%次氯酸鈉10 min消毒，在含有PVP 2 g·L-1的1/2WPM培養基上培養能較好地減少褐化產生。

　　由獲得率可知，極差R依次為B>C>A>D，說明影響蒜頭果無菌苗獲得的因素按主次排序為外植體>消毒方式>培養基>抗氧化劑;各因素最優水平組合為A3B3C1D1，即最佳的提高獲得率的方法為采用當年生靠近新梢末端半木質化部位作為外植體，通過0.1%升汞8 min + 2%次氯酸鈉 10 min消毒，在含有 2 g·L-1 PVP的1/2WPM培養基上培養。

　　減少褐化率和提高獲得率的各因素最優水平組合均為 A3B3C1D1，表明影響褐化率和獲得率的主要因素為外植體類型。

　　2.2　方差分析

　　褐化率方差分析見表3。根據F值，因素B對褐化率影響最大，達極顯著水平，因素A、C、D的影響未達顯著水平，即影響蒜頭果組培褐化的因素中，外植體類型的影響最顯著，是褐化的最主要因素，與直觀分析結果一致。

　　表2　L9(34)正交試驗設計與結果

　　

 

　　注：括號內為獲得率的統計;數據統計于接種后7 d。

　　表3　方差分析和多重比較

　　

 

　　注：F(2,2)0.01=9，F(2,2)0.05=19;*為顯著，極為顯著。不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平，不同大寫字母表示差異達0.01極顯著水平。

　　差異顯著性分析表明，外植體類型中，各水平間對褐化率的影響呈極顯著差異，莖梢褐化率最高，達81.10%;半木質化材料最低，為17.78%。消毒方式、抗氧化劑和培養基類型各水平間對褐化率的影響均無顯著性差異。上述結果說明，選擇半木質化枝條作為外植體是控制蒜頭果褐化最有效的途徑。

　　獲得率與污染率、褐化率有關，褐化率越低，污染率越低，則獲得率越高。根據獲得率方差分析的F值，因素A的影響最大，達顯著水平，即消毒方式對獲得率具有顯著影響。外植體、培養基、抗氧化劑等因素的影響均未達顯著水平，3因素各水平間獲得率也無顯著差異。

　　3　結論與討論

　　在植物組織培養中，一般通過選擇適當的外植體、消毒方法、培養基和生長調節劑，控制培養溫度和光照，培養基中添加抗氧化劑和碳粉，加快繼代轉瓶速度等綜合手段防止褐化。本研究中，影響蒜頭果組培褐化的最主要因素是外植體類型和抗氧化劑類型。因此，降低褐化率首要考慮蒜頭果外植體部位，試驗表明以當年生枝條半木質化材料最佳;其次是選擇合適的抗氧化劑種類和濃度，本試驗中，添加VC、Na2S2O3、PVP均能在一定程度上降低褐化率，以2 g·L-1 PVP最佳，這與劉蘭英的結論一致;最后考慮外植體消毒方法。培養基類型對蒜頭果褐化的影響較小，可不予考慮。綜上，在蒜頭果組織培養中，控制褐化并提高獲得率的最佳方法為采用當年生半木質化新梢為外植體，經0.1%升汞6 min + 2%次氯酸鈉10 min消毒，用含有2 g·L-1PVP的1/2WPM培養基培養。

　　褐化、污染和玻璃化是植物組織培養的三大難題，是決定組織培養成功與否的關鍵，本試驗發現，蒜頭果外植體的褐化發生較早，接種后24 h便有褐化產生，72 h后大部分已經褐化。因此，控制培養期間的溫度和光照，加快繼代轉瓶速度，調整植物生長調節劑配比等手段在蒜頭果組織培養上均不適用。蒜頭果組培褐化的控制應著重考慮外植體的選擇，另外輔助使用適宜的抗氧化劑。此外，蒜頭果枝葉中富含苯甲醛、苯甲醇，褐化外植體的傷口常產生橙黃色液滴。因此，外植體取材前黑暗處理，取材后預處理，降低枝條揮發油含量對控制蒜頭果組培褐化的效果值得進一步研究。

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