對木本觀賞植物組織培養的研究現狀進行了概述，總結了外植體類型、基本培養基種類、不同植物生長調節物質、環境條件等因素對木本觀賞植物組織培養的影響，并分析討論了組織培養過程中常見污染、褐化和玻璃化問題及其解決方法。

植物組織培養是指在無菌條件下，將離體的植物器官(根、莖、葉、花、果實、種子等)、組織(形成層、花藥組織、胚乳皮層等)、細胞(體細胞和生殖細胞)以及原生質體在人工配制的培養基上培養，并給予適當的培養條件，使其長成完整植株的過程。廣義的組織培養包括器官培養、組織培養、胚胎培養、細胞培養、原生質體培養、花藥培養等;狹義的組織培養是指植物離體組織再生快繁技術即微型繁殖(Micro-propagation)或試管繁殖技術。

1 木本觀賞植物組織培養研究概況

植物組織培養的理論依據是植物細胞的全能性。1902年，德國植物學家Gottlieb Haberlandt提出了離體細胞培養的概念，并將分離的完全分化的細胞進行了組織培養試驗。之后提出了激素控制器官形成的概念，使植物組織培養再生體系建立的研究達到了一個新水平。目前植物組織培養的應用和研究主要涉及到花卉、藥用植物、農林蔬菜等方面。木本植物由于普遍存在生長周期較長，體細胞中含有較多的多酚類物質易導致植物材料褐化，短期經濟效益較低，科研難度較大等現象，其組織培養研究相對較少。但經過長期探索，木本植物的組織培養技術也取得了一定成就。1934年法國學者Gautheret進行的裸子植物組織培養研究，被認為是木本植物組織培養研究的開始。

目前，楊柳科、薔薇科、木犀科、?？?、松科、杉科、鼠李科、大戟科、紫茉莉科、棕櫚科中的約近100種木本觀賞植物能夠實現組培快繁，并有10余種已進行大面積推廣，如杉木(Cunninghamia lanceolata)、柳葉桉(Eucalyptus saligna)等。另外，約有20種針葉樹的外植體誘導體細胞胚成功，如紅松(Pinus koraiensis)、油松(P.tabulaeformis)及云南松(P.yunnanesis)等，在20余種闊葉樹種的組織培養中觀察到體細胞胚胎發生或獲得再生植株，如花楸樹(Sorbus pohuashanensis)已在實驗室條件下完成了從未成熟和成熟合子胚中誘導出體細胞胚，并再生出體胚苗;柑橘(Citrus reticulata)胚性細胞系的建立和體細胞胚發生技術已較成熟。在胚乳培養方面，已能夠誘導出愈傷組織、胚狀體或已經能夠分化出根，但只有10多種木本觀賞植物獲得了胚乳植株，如中華獼猴桃(Actinidia chinensis)、羅田甜柿(Diospyros kaki‘Luotian-tianshi’)等。能夠成功進行原生質體分離培養的樹種達40多種，其中桑樹(Morus alba)、蘋果(Malus pumlia)、毛白楊(Populus tomentosa)、白榆(Ulmus pumila)、二球懸鈴木(Platanus hispanica)等10多種樹木已通過這種途徑建立了再生體系。

應用組織培養技術建立植物再生體系，能夠極大地促進木本觀賞植物品種改良和分子育種的發展。選擇合適的再生途徑對建立木本觀賞植物再生體系十分重要，根據再生過程經歷的途徑不同，木本觀賞植物的離體再生途徑大致可分為頂芽或腋芽途徑、不定芽途徑、胚狀體途徑、原球莖途徑。頂芽或腋芽途徑是木本植物組培快繁應用最廣泛的方法，珙桐(Davidia involucrata)、銀杏(Ginkgo biloba)、胡桃(Juglans regia)、云南山茶(Camellia reticulata)、桑樹等很多木本觀賞植物都成功使用了該方法;在不定芽途徑中常用的外植體有莖尖、莖段(鱗莖、塊莖、匍匐莖)、花芽、葉、葉柄、根、花莖、萼片、花瓣、花托等，在木本觀賞植物中，報道使用這種方式繁殖成功的也較多，如翅果油樹(Elaeagnus mollis)、杜仲(Eucommia ulmoides)等;使用胚狀體途徑試驗成功過的有蘇鐵(Cycas revoluta)等;目前，原球莖途徑正處于試驗研究階段，尚未見使用這種方式成功快繁木本植物的報道。

在木本觀賞植物再生體系建立過程中，使用頂芽或腋芽途徑的多數經過3個階段即可完成植株再生，依次為愈傷組織的啟動、增殖與生根階段，如廣玉蘭(Magnolia grandiflora)、麻竹(Dendrocalamus latiflorus)等;有些需經過4個階段，即啟動、增殖、壯苗、生根，如變葉木(Codiaeum variegatum)、合歡(Albizia julibrissin)等;少數將啟動培養和增殖培養合二為一經過2個階段即可完成，如臘梅(Chimonanthus praecox)等。使用不定芽途徑或胚狀體途徑的一般經過4個階段培養完成植株再生，如華北落葉松(Larix princilis-ruppiechtii)等;也有經過3個階段的，即將愈傷組織的誘導與分化合為一步，如雪柳(Fontanesia fortunei)等。各步驟之間無嚴格固定的界限，具體分法要根據具體要求和條件來確定。

2 影響木本觀賞植物組織培養的主要因子

建立一個木本觀賞植物快繁體系需要考慮的因素有很多，其中主要涉及合適的快繁途徑、外植體類型、基本培養基類型、激素和其他添加物的種類和配比、環境條件的控制等，近幾年的研究也主要圍繞在這方面。

2.1 外植體 外植體類型是木本觀賞植物組織培養的重要影響因子之一。從理論上來說，植物的各個器官和組織均可用于組織培養，但大量研究表明，樹木的不同組織或部位及其所處的發育階段或生理狀態在器官發生能力上有相當大的差別。采集外植體時應根據組培目標和快繁途徑以及所用植物的生態習性選擇合適的外植體類型，一般選擇幼嫩的器官或組織，如莖尖、幼葉、胚、子葉、下胚軸等，也有適合用莖段、成熟葉片、根、髓、花器官等作為外植體的。

對芽和莖段進行誘導愈傷試驗，發現在相同培養條件下，芽為外植體產生愈傷組織的時間早，誘導率高，且愈傷組織生長速度快;蘋果組培研究表明，以葉片作外植體時，以新梢頂端將展開幼葉的植株再生能力強，葉片的中部比頂部或基部更易于再生植株，葉片近柄端愈傷組織發生較早;李慧等在銀白楊(Populus alba)葉片不定芽再生影響因素的研究中發現誘導出芽時間和再生率自上而下依次遞減。

2.2 培養基 組織培養中，植物材料附著在培養基上并且從中吸收所需要的各種物質，不同的培養基對有目的的組織培養非常重要。大多數植物組織培養所用的培養基中均含有無機營養物質、碳源、有機添加物、植物生長調節劑和膠凝劑。

不同類型植物或者外植體適宜的培養基不同。研究表明，在B5培養基上，莖段愈傷組織誘導率高于葉片，而在MS培養基上，葉片愈傷組織誘導率高于莖段。培養階段或者培養目標不同，合適的培養基也不同，一般認為較低的無機鹽濃度、高生長素濃度和低細胞分裂素濃度利于生根，如毛葉棗(Zizyphus mauritiana)在啟動和增殖階段使用MS培養基生長較好，但生根階段卻以1/2 MS培養基為宜;誘導銀杏莖段愈傷組織適宜的培養基為MS，分化芽的最適培養基為1/2 MS，而誘導根卻在White培養基上。竹子在離體快繁的過程中更易見到試管苗開花，這實際上是由于營養供應不全或不足時營養生長不正常而轉向生殖生長，從而出現花芽分化導致開花。此外培養基的存在狀態也能影響組培效果，如使用液體培養基更能促進山茶花生根等。

2.3 激素 在植物組織培養中，外源激素的種類、質量濃度和配比是主要的因素之一。一般使用的激素有生長素類、細胞分裂素、赤霉素類、脫落酸、乙烯、油菜素甾體類物質等。

木本觀賞植物組培中常用的細胞分裂素類物質有6-BA(6-芐基腺嘌呤)、KT(激動素)、ZT(玉米素)、TDZ(噻重氮苯基脲)等。細胞分裂素對組培中不定芽的分化及增殖有著顯著的作用，其中6-BA使用廣泛，使用濃度范圍大多在0.05～3.00 mg/L，但也有例外，如野生荔枝(Litchi chinensis var.euspontanea)的種子萌發培養基中6-BA的濃度達到了20 mg/L。有些細胞分裂素對愈傷組織的形成也有明顯作用，如KT和6-BA，兩者的作用各有特點，6-BA能促進細胞分裂，有利于愈傷組織的形態建成;KT對愈傷組織誘導率的影響不大，但在誘導培養基中添加適量的KT可改善愈傷組織的質量。還有研究表明，對誘導不定芽發生，TDZ在某些樹種中表現出了特別的效果，如0.002～0.050 mg/L的TDZ可誘導花楸、刺槐(Robinia pseudoacacia)等植物形成大量的芽，誘導能力是6-BA的50～100倍。

木本觀賞植物組培中常用的生長素是2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)等。在誘導愈傷組織和誘導生根的時候往往以生長素為主，大多數植物都能在添加2，4-D的培養基上誘導出愈傷組織，但2，4-D有抑制芽形成的副作用，而且過量使用會產生毒害作用，因此在愈傷組織誘導階段，添加外源生長素類時應優先考慮采用NAA、IAA，如兩者都不能完成愈傷組織誘導時，再考慮采用2，4-D誘導。已有試驗證明，適宜濃度的NAA可以替代2，4-D。在誘導愈傷組織時，一般還需要添加一定量的細胞分裂素，這樣可使獲得的愈傷組織更具有胚性。

大量研究表明，在培養過程中，有時候使用單一某種激素即有效果，使用芽作為外植體時，發現培養基中添加適宜濃度的2，4-D和NAA即可使愈傷組織誘導率高達100%，說明當外植體細胞分裂能力較強時，只使用細胞生長素也可誘導愈傷組織。但很多時候使用某一種激素的同時，添加少量其他激素可取得更好的效果，利用莖段作外植體，在B5培養基中添加NAA(3.0 mg/L)和6-BA(0.1 mg/L)，使愈傷組織誘導率達100%。也有些植物要使用2種或以上的激素才能夠起作用，如在含有BA的培養基中，檸條(Caragana korshinkii)要通過加入2，4-D才能形成愈傷組織，而花棒((Hedysarum scoparium)、羊柴(H.leave)需要再加入IAA來誘導形成愈傷組織。

一般認為，培養基中生長素和細胞分裂素的比值高時，有利于根的分化或愈傷組織的形成，比值低時，則利于芽的分化。但也有例外，如紫杉(Taxus cuspidata)莖尖能誘導出不定芽與不定根，但不定芽的形成與6-BA/IBA比值和母樹樹齡有關，而不定根的形成主要取決于IBA的質量濃度與母樹樹齡。

2.4 其他添加物 木本觀賞植物組織培養中，還經常需要加入其他的有機物等外源添加物，如椰子乳、天冬酰胺、谷氨酰胺、CH(水解酪蛋白)和 GA3(赤霉素)、AgNO3、PP333(多效唑)、活性炭、間苯三酚、核黃素、氯化膽堿、青霉素等。例如，在進行壯苗培養時加入赤霉素可以促進莖的伸長;在培養基中添加活性炭能夠提高生根苗的質量。

2.5 環境條件 光照、溫度、培養時間、繼代次數等環境因素也能明顯的影響組培效果。采用赤桉(Eucalyptus camaldulensi)葉片誘導不定芽時，先暗培養10 d后再轉移到16 h/d的光暗交替培養條件下，其不定芽的誘導率要高于全程光下培養的誘導率，但隨著暗培養時間的延長，不定芽誘導率會下降;蘋果進行生根培養時往往需要先在根原基誘導培養基中黑暗條件下培養5～7 d，根原基產生后再轉入不定根伸長培養基中培養;研究了日平均溫度20℃下的3個不同溫差，即+10℃(光期25℃，暗期15℃)、0℃(光期20℃，暗期20℃)、-10℃(光期15℃，暗期25℃)變溫處理對組培苗的作用效果，結果表明苗體高度隨溫差的增大而增大，但苗的干重和鮮重不受溫差影響;很多植物在多次繼代后變異幾率可能會增加，而有些植物卻能長期繼代，如月季等在多次繼代后仍能長期繼代，且可保持原來的再生能力和增殖率;在檸檬桉的生根培養階段，需要繼代培養幾次后才能發根;月季等在移栽前需要在生根培養基上培養一段時間(無論生根與否)，然后再移栽更易成活。

3 木本觀賞植物組織培養中常見的問題及處理

褐化、污染、玻璃化是木本觀賞植物組織培養再生體系建立過程中常見的問題。

3.1 褐化 木本植物體細胞內含有較多的酚類化合物，當細胞膜的結構發生變化和破壞時，這些物質相互接觸發生一系列酶促反應，形成有毒害的褐色物質，外植體隨之進一步變褐死亡，這種現象稱為褐化。同時，發生褐化的組織也會向培養基內釋放褐色物質，以至危害到周圍的材料。在培養基中加入Vc可有效的防止褐化;蛋白水解產物、多胺等物質也可作為抑制劑來防止褐變的發生。此外，選擇合適的消毒劑和消毒方法，適當低溫，適當降低培養基的pH，適當降低培養基中無機鹽的濃度，降低接種密度，縮短轉瓶周期等也可減輕褐化的發生和危害。還有不少研究表明光照也能影響褐化，但在不同植物種類中表現出的規律不同，甚至相反。同時還要注意，一些因素具有多重影響，如活性炭也能有防止褐化，但活性炭也能吸附培養基中的一些其他有機物，所以在加入活性炭的培養基中應適當調整激素配比使其維持在適宜的水平。

3.2 污染 對于外植體本身帶菌，可針對外植體的選取和消毒2方面處理。對母株進行預處理，采集外植體時盡量選取帶菌少的材料。給外植體消毒的時候，一般使用酒精和升汞結合的消毒方法，還有一些比較特殊的方法，如減壓滅菌法、臭氧消毒法、間隙消毒法、超聲波振動滅菌等，另外，用多菌靈和青霉素的混合液處理污染程度較輕的月季(Rosa chinensis)帶芽莖段也能獲得較好效果;沖洗外植體時或消毒時加入少量表面活性劑可提高去污和消毒殺菌效率;在培養基中加入適量抗生素等抗菌劑也有一定效果，但長期使用可能會出現耐藥性。在實際操作中，往往綜合使用多種方法來達到效果。

在進行接種操作時和培養過程中，為防止帶入微生物引起污染，需及時更換切割外植體時使用的無菌盤，使用2套鑷子和手術刀以提高工作效率和減少交叉污染的幾率;在首次培養時，若不清楚污染率大小，則宜選用小容器、多數量、盡量分散、相互隔離的培養方法，以減少可能的損失，也便于統計污染率。

3.3 玻璃化 玻璃化(Vitrificatiion)，又稱超水化(Hyperhydration)，是指在培養過程中材料呈半透明狀、組織結構發育畸形的現象。發生玻璃化的材料分化能力降低，極易引起植株死亡，且不易移栽成活。玻璃化的成因較復雜，目前研究較多的是培養基水勢、細胞分裂素和碳源的狀況。一般情況下，適當增加瓊脂濃度，降低培養基的襯質勢，適當通氣以降低培養容器內的相對空氣濕度和乙烯含量，同時改善氧氣和CO2的供應狀況，適當降低培養基中NH4+濃度，并提高培養基中的Ca2+濃度，適當增加自然光照等均可減輕玻璃化的發生幾率。此外不少研究表明，細胞分裂素和生長素的配合以及激素和K+之間的配合也能影響玻璃化的發生，但具體原因尚不清楚。

近些年來，木本觀賞植物組織培養技術已在微繁殖、植物脫毒、培育新品種、生產次生代謝產物、種質資源保存以及生命科學研究等方面取得了較大的理論研究進展和一定的社會效益，但仍然存在一些問題，如研究范圍較窄、不夠系統化、技術不夠穩定成熟，經常會遇到畸形苗、褐化、玻璃化和污染等問題。因此，今后應擴大研究范圍，增加科研投入，加強基礎性研究的深入和理論體系的構建，注重組培研究和生產的市場化運作等，讓這項技術更好的服務于科學發展和生產實踐。

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