榿葉唐棣(Amelanchier alnifolia Nutt.)又名 Saskatoon berry，歷史上被稱為“鴿莓”，是薔薇科(Rosaceae)唐棣屬的落葉灌木或小喬木，高1.5～3.0 m，果實為小漿果，為北美洲重要的經濟林樹種，是國際市場新興的第三代水果的代表。自1999年承擔國家林業局“948”項目的遼寧省干旱地區造林研究所從加拿大成功引種榿葉唐棣后，其展現出良好的發展前景。鑒于榿葉唐棣扦插繁殖和種子育苗皆較困難的現實情況，開展了組培快繁的研究，迄今已實現關鍵技術的突破，為工廠化育苗奠定了基礎?，F將榿葉唐棣組培育苗技術總結如下。

　　1 所需設備及化學試劑

　　組培實驗室必須選建在安靜、清潔、無污染的地方，接種設備包括超凈工作臺、解剖刀、鑷子、酒精燈、醫用小推車、廣口瓶、白瓷碟、無菌濾紙;滅菌設備包括高壓蒸汽滅菌鍋、紫外線燈、烘干箱;滅菌藥劑及輔助劑包括75%C2H6O、90%C2H6O、0.1%HgCl2、高錳酸鉀、甲醛、84 消毒液、洗衣粉、餐洗凈等;培養基及植物生長調節劑包括MS培養基、6-BA、NAA、IBA、白糖、瓊脂等;培養設備包括300 mL培養瓶、培養架、空調、照明燈管;其他輔助試驗設備包括冰箱、電子天平(0.01 mg、0.001 mg)、磁力攪拌器、酸度計、照度計、溫濕度表、移液槍、移液管、試劑瓶、容量瓶、燒杯等。

　　2 生產環境及設備消毒滅菌

　　2.1 培養瓶清洗與消毒

　　將使用過的培養瓶或盛培養基和培養物的玻璃器皿中的污物倒掉，再浸入水中進行洗滌。有微生物污染的器皿，必須先進行高壓消毒或煮沸，殺死菌體后放入水中洗滌。器皿洗凈后，烘干或晾干，放在規定的地方以待取用。

　　2.2 接種器械滅菌

　　一是高壓蒸汽滅菌。使用前，將接種器械、器皿及定性濾紙用牛皮紙包裹后，再用聚丙烯薄膜裹緊并包扎，然后與分裝后的培養基一起放入高壓鍋的消毒桶內滅菌。鍋內滅菌物以不超過滅菌鍋容量的3/4為宜，高壓滅菌時鍋內使用蒸餾水。打開電源加熱，壓力保持在0.105～0.120 MPa(壓力<0.140 MPa)，時間為30 min。二是灼燒滅菌。在無菌操作時，將鑷子、剪刀、解剖刀等浸入250～500 mL裝有75%C2H6O的廣口瓶中，使用之前取出并在酒精燈外焰處灼燒滅菌，冷卻后立即使用。每次重新操作都要將工具放在火焰上消毒。

　　2.3 準備室消毒

　　堅持每天用84消毒液(稀釋成1 000倍液)或75%C2H6O噴灑、洗滌準備室地面，保持室內清潔。

　　2.4 接種室及培養室消毒滅菌

　　房間密閉，將甲醛5～38 mL/m3置于廣口容器中，加高錳酸鉀5 g/m3氧化揮發，熏蒸2～3 d，通風無味后2～3 d人員方可進入。接種室每30 d用高錳酸鉀及甲醛混合熏蒸1次，培養室每60 d用高錳酸鉀及甲醛混合熏蒸1次。工作期間每3 d用75%C2H6O噴霧消毒1次。轉接操作前，接種室、超凈工作臺等皆要用紫外線燈照射25～30 min。

　　3 無菌操作

　　入無菌室前洗手，去掉指甲中的污物;入室時要穿戴上經過消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等;工作人員進行無菌操作前，要用75%C2H6O擦洗雙手，并用75%C2H6O擦拭操作臺臺面及內壁;操作中要經常用75%C2H6O擦洗手。操作時，右手拿培養瓶，左手輕輕拉開瓶口綁繩放在臺面上，再用左手中指和無名指夾住封口膜后掀開，將培養瓶口傾斜靠近酒精燈火焰上旋轉灼燒數秒，用灼燒消毒冷卻后的鑷子將轉接材料接種至培養基中，每個培養容器中接種小芽叢或單芽3～4株，且分布均勻，接種后蓋上封口膜包扎，并標注日期;接種時，在無菌濾紙上切取材料，刀和鑷子等接種工具每次使用后即放入75%C2H6O中浸泡，然后灼燒放涼備用。接種時，超凈工作臺上的風機要始終保持開啟狀態，確保通風順暢;操作過程中不準講話，亦不準對著操作區呼氣。每次接種完畢后，用75%C2H6O將工作臺臺面及內壁擦拭干凈，并將接種器皿及接種工具重新進行消毒處理。

    

　　4 培養基制作

　　4.1 培養基母液的配制與保存

　　選用試劑純度為化學純或分析純的化學藥品，根據MS培養基配方，分別配制大量元素(10倍)、微量元素(100倍)、鐵鹽(100倍)、有機物(100倍)，母液配制使用蒸餾水或去離子水。配制好的培養基母液要分別貼上標簽，標注名稱、配制倍數和日期，置于2～4℃環境下保存。鐵鹽應儲存在棕色容器中。

　　4.2 植物生長調節劑母液的配制與保存

　　榿葉唐棣組培中用到的植物生長調節劑有NAA、IBA和6-BA。配制NAA、IBA母液時，可先用少量95%C2H6O溶解，再加蒸餾水定容;配制6-BA母液時，可先用少量0.1 mol/L HCl溶解，再加蒸餾水定容。母液配制好后儲存在棕色容器中，貼好標簽并置于冰箱內保存，溫度控制在0～4℃之間。

　　4.3 培養基的配制、滅菌及保存

　　根據培養基配方需求，稱取瓊脂(8g/L)、白糖(30～35g/L)，用最終培養基體積70%～80%的水加熱溶解，然后按計算的量依次加入MS母液、植物生長調節劑，定容后用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl溶液調節pH值至5.5～5.8，定量分裝至培養瓶中并封口、標記。瓶裝培養基應在12 h內完成滅菌程序，采用高壓蒸汽滅菌方式滅菌，在壓力0.105 MPa、溫度121℃條件下滅菌15～20 min。滅菌后的培養基放入接種室，避光、防塵保存，常溫條件下保存，7 d內使用完;2～4℃條件下保存，14 d內使用完。

　　5 外植體處理

　　5.1 外植體采集

　　生長旺季，在晴天或露水干后剪取生長健壯母株上較幼齡的最幼態部位作為外植體。外植體宜當天采集、當天處理，運輸過程中要注意低溫、保濕，迅速帶回組培室。

　　5.2 外植體莖段修剪

　　剪下植株后去除葉片，留取有用莖段。莖段長度4～5 cm，剪段要求留1～2個出芽點。

　　5.3 外植體清洗

　　修剪好的莖段按木質化程度放置于不同的燒杯中，加入餐洗凈進行表面沖洗。沖洗1～2 h后，置于超凈工作臺(已開機、滅菌20 min以上)備用。

　　5.4 0.1%升汞配制

　　稱取1 g升汞，加蒸餾水溶解，定容至1 L，裝入棕色瓶中，用封口膜扎緊瓶蓋，貼上標簽，標明配制濃度、日期。注意使用升汞消毒液應按照國家有關劇毒化學藥品使用的法規進行作業，詳情可參見《醫療用毒性藥品管理辦法》。

　　5.5 無菌水準備

　　將純凈水裝入玻璃瓶中，扎緊封口膜，放入高壓鍋內滅菌 30 min，保持鍋內氣壓在 0.10～0.11 MPa(120～122 ℃)。

　　5.6 外植體表面滅菌

　　用75%C2H6O浸泡30 s，無菌水沖洗 2～3次，然后按材料的木質化程度分別用0.1 HgCl2浸泡6～8 min，最后用無菌水沖洗5～6次。

　　6 組織培養程序

　　6.1 無菌培養體系的建立

　?、僬T導培養基配方。MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.12 mg/L+IBA 1.4 mg/L+糖35 g/L+瓊脂8 g/L。②外植體接種。將表面消毒的外植體切去兩端，切成1～2 cm長單芽，按照正常生長方向接入腋芽誘導培養基中誘導營養芽。③培養條件。培養室溫度設定為(25±2)℃，光照強度為 2 500～3 000 lx，光照時間為 14～16 h/d。④培養周期。培養時間為 40～50 d。⑤褐化苗處理。關閉照明電源，進行暗培養;降低培養室溫度至15～20℃;將褐變苗轉入新培養基，然后每天繼續轉1次，連續轉7 d。

　　6.2 繼代增殖

　?、倥囵B基配方。MS+6-BA2.5mg/L+IBA1.0mg/L+糖35g/L+瓊脂8 g/L。②叢生芽接種。當初代誘導的不定芽長到1.5 cm及以上時，將萌發的幼芽從基部切下，去掉莖尖，并接種到繼代培養基中進行不定芽的增殖培養。③培養條件及培養周期。培養條件同5.1，培養周期30～45 d。④繼代苗質量標準。無污染、無玻璃化、葉鮮綠、生長健壯。⑤玻璃化苗處理。低溫處理，增加瓊脂濃度，增加光照。

　　6.3 生根培養

　?、偕囵B基配方。1/2 MS+NAA 1.5 mg/L+IBA 1.5 mg/L+糖30 g/L+瓊脂8 g/L。②生根苗接種。將1.5 cm以上、生長健壯的不定芽切成單芽接種在生根培養基中。③接種株數。每瓶接種10株或15株(以方便計數)。④培養條件及培養周期。培養條件同5.1，培養周期45～60 d。⑤生根率及生根苗質量標準。生根率≥90%，生根苗質量標準為葉片綠色、株高≥3.0 cm、根莖粗≥0.1 cm、節間2～3個、單株復葉數≥4片、根白色柔軟、根數≥6條、平均根長1.5～2.0 cm。

  

　　7 煉苗

　　煉苗季節為4—6月或8—9月。一是強光閉瓶鍛煉。將瓶裝試管苗移至日光溫室或大棚，溫度控制在35℃以下，保留瓶蓋繼續培養10 d左右。二是強光開瓶鍛煉。閉瓶鍛煉結束后，除去瓶蓋繼續鍛煉2～5 d，在培養基表面出現大量雜菌前進行移栽[4]。

　　8 移栽

　　移栽基質配方為草炭土∶細河沙∶壤土=3∶5∶2?；|過篩后混勻，混勻過程中噴灑0.2%代森錳鋅水溶液消毒，混勻后覆膜堆漚、壓嚴，3 d后裝杯。

　　移栽容器為塑料營養缽，規格為8 cm×6 cm×7 cm。

　　移栽前，用自來水將根系上的培養基沖洗干凈，再用0.1%多菌靈溶液浸泡組培苗根部3～5 s，然后栽入已準備好的營養缽中。

　　9 移栽后管理

　　溫度控制在(30±2)℃。栽完1個苗床，澆足定根水后搭建高50 cm、寬1.2 m、長6.0 m的塑料小拱棚。移栽后前3 d，每天早、晚各噴1次水，保持空氣濕度80%～90%;3 d后，逐漸揭膜通風直至完全去除塑料薄膜。移栽后的前20 d，用遮光率為75%的遮陽網進行遮蔭;20 d后，逐漸卷起遮陽網增加透光率，直至完全去掉遮陽網。根腐病防治措施為栽后馬上噴施1∶1∶100的波爾多液預防，以后每隔7 d噴施1次;發病初期用采用0.1%甲基托布津或0.1%多菌靈溶液交替噴灑根莖部，連續防治2～3次，間隔期為7 d。根部蟲害防治措施為噴施0.1%毒死蜱，連續防治2～3次，間隔期為7 d。移栽20 d后，葉面噴施0.3%磷酸二氫鉀;移栽30 d后，配合澆水，水中適量加入磷酸二銨，亦可每隔20 d噴施1次1/8MS母液1 000倍液。

　　10 定植

　　在翌年春末至夏初(5—6月)，選擇苗高 15～20 cm、根莖粗≥0.5 cm、根系發達的苗木定植。定植方法為將組培苗帶移栽基質定植至苗圃，并噴施0.05%～0.10%的抗蒸騰劑CaCl2或 NaHSO3。

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