白牡丹由景天科石蓮花屬多肉植物靜夜與風車草屬朧月雜交培育而來，是目前較為流行的多肉園藝品種之一。白牡丹莖葉肉質化，全株被白粉，互生葉排列成蓮座形，如牡丹花綻放，具有很高的觀賞價值。白牡丹繁殖方式目前僅局限于扦插以及分株繁殖，白牡丹規模繁殖一直存在技術瓶頸。因此，對于白牡丹組培快繁技術進行研究具有一定意義，本研究將為白牡丹組培擴繁提供試驗依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　試驗材料為西南林業大學大棚內種植的多肉植物白牡丹。選取的外植體分別為白牡丹植株的葉片、莖段。

　　1.2 試驗方法

　　1.2.1 培養條件 本試驗采用MS為基本培養基，附加 0.4% 1 500 g/cm2強度卡拉膠、30 g/L蔗糖，pH值調節至 5.8～6.0，121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min備用。選用日本三洋MLR-351H型培養箱進行組織培養，光照度設定為 3 000 lx，設定每天的光照時間為18 h，培養溫度為25 ℃。

　　1.2.2 材料與消毒 選取長勢良好的植株莖段與葉片為供試材料。葉片要求為從基部與莖段分離的完整葉片，葉片飽滿挺拔、表面無傷痕;莖段要求為當年生幼嫩莖段，表面無傷痕、無蟲害。剪取材料后，將材料首先置于洗衣粉中浸泡約10 min，在浸泡過程中，用軟毛刷輕輕刷洗，將材料表面殘留的污物清除;之后再將材料置于流水中沖洗，沖洗約3 h，沖洗完成后，將材料置于超凈臺內，用75%乙醇快速浸泡15 s;取出后立即置于無菌水中清洗，再用0.1% HgCl2消毒，設置4、8、12、16 min 4個時間梯度的消毒處理，之后用無菌水清洗 5～6次，總清洗時間不少于15 min;將清洗后的材料置于滅菌濾紙上吸去多余水分，接種入MS空白培養基中，每瓶接種1株，每個處理20瓶，3次重復。3 d后開始記錄污染率、污染類型、死亡率，之后每天記錄1次，15 d后結束記錄。

　　1.2.3 誘導培養 以MS為基本培養基，分別附加不同含量的NAA、6-BA(表1)，使用之前試驗中所得的最適外植體材料以及最適消毒方法，將外植體接種于分別附加不同激素含量的培養基中，每種處理接20瓶，每瓶接種1株，重復3次，30 d后統計誘導情況。

　　1.2.4 增殖培養 根據初代培養中白牡丹無菌苗誘導培養的長勢情況，確定白牡丹無菌苗的增殖培養方式。將初代培養中誘導得到的白牡丹叢生芽或愈傷組織接種于以MS為基本培養基，分別附加不同含量NAA、6-BA、KT的培養基中，進行增殖培養，采用L9(34)正交試驗設計(表2、表3)，每種處理接20瓶，每瓶接種3株，重復3次，30 d后統計增殖情況。

　　表1 白牡丹無菌苗誘導培養的試驗方案

　　

 

　　表2 增殖培養L9(34)因素與水平

　　

 

　　表3 L9(34)正交設計試驗方案

　　

 

　　1.2.5 生根培養與煉苗移栽 采用1/2MS培養基進行生根培養，當植株長至4～5 cm時進行煉苗移栽。煉苗基質采用椰糠+珍珠巖以1 ∶1體積比例混配，121 ℃高壓蒸汽滅菌對基質進行消毒。由于景天科植物生根較為容易，故分別選取未經生根培養、經過生根培養且根長為4～5 cm的2種材料進行煉苗培養。先將瓶口打開，逐漸與外界環境接觸，提高種苗的適應能力，5 d后將小苗取出，在自來水下用鑷子、軟毛刷等洗凈附著在根部的培養基，種于含水量不同的基質中(表4)，每個處理接種20株苗，3次重復，保持空氣濕度在70%以上，30 d后統計成活率及根系情況。

　　表4 白牡丹無菌苗煉苗培養方案

　　

 

　　2 結果與分析

　　2.1 不同植物器官及不同HgCl2消毒時間對外植體成活率的影響

　　表5顯示，隨著HgCl2消毒時間的增加，污染率大幅度降低，這說明使用HgCl2處理對材料表面所攜帶的污染物具有較好的滅殺效果;但是隨著HgCl2處理時間的延長，植物成活率明顯降低，說明過長時間的HgCl2接觸會對白牡丹外植體造成較大傷害。

　　表5 不同植物器官及不同HgCl2消毒時間對外植體的影響

　　

 

　　不同植物器官用HgCl2處理的效果也是不同的，使用莖段作為外植體時，大部分處理成活率要低于以葉片為外植體的處理組，這說明相比莖段，葉片更適宜作為外植體。同時，使用莖段作外植體時，3 d后的污染率仍然在不斷上升，與 15 d 時相比，各處理的污染率上升幅度均大于以葉片為外植體的處理組，這一現象可能與莖段上存在滅菌死角、自身所帶的內生菌較多有關，也進一步說明了相比莖段，葉片更適宜作為外植體。

　　綜合白牡丹生長特性，由于白牡丹自身生長速度緩慢，難以取得如花莖這類內生菌相對較少的外植體材料，故較適的外植體材料為葉片，最佳消毒處理方法為采用75%乙醇處理15 s、0.1% HgCl2處理12 min。

　　2.2 不同培養基下無菌苗的誘導培養

　　表6顯示：使用白牡丹葉片為外植體，在合適培養基配方下葉片即可以直接誘導出大量叢生芽。在試驗中發現，NAA與6-BA含量比值與叢生芽的發生有密切關聯，6-BA含量范圍為1～3 mg/L時，當6-BA/NAA值<10，則大部分葉片開始只生根不長芽，最終葉片死亡;當6-BA/NAA>10時，大部分葉片逐漸開始發生膨大，最終形成水漬狀的愈傷組織;6-BA/NAA值=10時，叢生芽誘導效果最好。當6-BA含量為2 mg/L、NAA含量為0.2 mg/L時，白牡丹叢生芽誘導效果最好，在滅菌接種約8 d時，葉片首先出現一定膨大，部分區域發生開裂，可見內部嫩綠色膨大組織;之后15 d左右時，在近基部的葉片區域以及葉片開裂的區域內，萌發出大量叢生芽，叢生芽平均萌發量達10.8芽/張，誘導效果良好。

　　2.3 不同培養基下無菌苗的增殖培養

　　由表7可見，第3組處理2 mg/L 6-BA+2 mg/L KT的增殖倍數最高，但增殖長勢最差，出現了嚴重的玻璃化現象，導致之后無法正常繼代生長，故此配方不具備可行性;而在第1組不添加激素的培養基中，叢生芽長勢最好，說明此培養基適合作為白牡丹的壯苗培養基使用，在出現叢生芽長勢變差、需要壯苗生根時，可選用此配方。綜合各組增殖倍數以及長勢來看，第9組0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA +1 mg/L KT為最佳增殖培養基處理，在此激素組合下叢生芽有較高的增殖倍數，在長勢上也較為良好，利于轉接繼代。

　　由表8可以看出，KT、6-BA在0.05水平下影響顯著，說明這2種激素在叢生芽增殖時與增殖倍數有著較大相關性，而KT影響度相較于6-BA更大，說明KT對于白牡丹叢生芽的增殖倍數較6-BA更為敏感。NAA對叢生芽增殖倍數影響較小，結合叢生芽增殖長勢，NAA含量可能與維持叢生芽正常形態有關，通過配合NAA的添加，使得叢生芽在高速增殖的同時仍然保持一定的正常長勢，避免出現玻璃化現象。

　　表6 30 d時不同培養基下叢生芽誘導情況

　　

 

　　表7 30 d時不同激素組合下叢生芽增殖情況

　　

 

　　注：“+”表示長勢情況，“+”越少表示越趨向于玻璃化，“+”越多表示叢生芽越壯。

　　表8 不同激素組合對增殖倍數的方差分析結果

　　

 

　　2.4 煉苗移栽

　　白牡丹的煉苗與常規組培苗煉苗區別較大。首先，組培苗所產生的根系在煉苗過程中難以存活，這表明在白牡丹快繁過程中不宜進行瓶內生根。此外，在白牡丹的煉苗過程中進行保濕處理并不利于其生長，而相對干燥的環境更加利于白牡丹新根的萌發及存活。組培苗切根后移栽于保持濕潤的介質中，大部分植株在8 d左右時切口處即發生潰爛，導致植株死亡。由表9可見，帶根的組培苗在保持濕潤的介質中始終無明顯變化，30 d內未見新根形成，且有部分組培苗出現潰爛死亡。帶根的組培苗移栽于干燥介質中，雖然根系很快出現死亡，植株出現了萎蔫現象，但大部分植株在25 d左右后即出現了新根并存活下來，只有少部分植株死亡。將組培苗切根后移栽入保持干燥的介質中，相比以上幾組植株成活情況好，植株移栽后在12 d時即見新根產生，煉苗成活率可達95%。

　　表9 白牡丹無菌苗煉苗30 d后的生長情況

　　

 

　　3 結論與討論

　　不同多肉植物，根據自身特性的不同，可以用不同的誘導方式以及增殖手法來進行組培擴繁。在實際操作中，需要視無菌苗生長情況進行科學選擇，如大和錦、玉露、十二卷、壽等這些多肉，首先需要通過誘導形成綠色球狀小體或愈傷組織，再來誘導產生叢生芽。本試驗中的白牡丹，在對葉片進行誘導時直接就可以誘導出叢生芽，通過對叢生芽的增殖培養，即可獲得高效增殖擴繁體系，若對其進行愈傷誘導培養反而影響了其增殖進程，沒有太大意義。

　　在增殖培養中，經過方差分析發現，白牡丹叢生芽增殖倍數與KT、6-BA顯著相關，而NAA雖然與增殖倍數無顯著相關，但與叢生芽形態關聯密切，叢生芽在NAA與KT、6-BA組合下達到最優繁殖水平，這與宋曉濤等的研究結論基本一致，但夏時云等在對龜甲龍的增殖培養中，使用NAA與KT的組合配方也取得良好繁殖。同時，本研究中KT與增殖倍數的相關性較6-BA高，這說明有可能僅使用KT的效果也會較好，這還有待進行驗證。

　　在對多肉植物的煉苗過程中，常規的保濕條件并不利于多肉的煉苗與移栽。在相對干燥的情況下，白牡丹植株不但沒有出現萎蔫枯死的現象，反而有利于新根的萌發，這與多肉植物平時的養護種植有一定類似，在常規繁殖中，也是相對干燥的環境更有利于根系產生及植株生長，這可能是由多肉植物原本的生境以及自身的一些特性所決定的，具體是哪些因素造成的，也有待進一步研究。

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