洋蔥產業是一個效益顯著的產業，有利于農村產業結構調整，不僅能滿足國內市場需求，也為我國出口創匯做出重要貢獻，目前我國的洋蔥種植面積和產量已成為世界上的第一大國。雖然洋蔥在我國蔬菜生產中占重要地位，但是由于我國洋蔥品種資源匱乏，育種單位少，科研投入不足，生產上嚴重缺少有自主知識產權的洋蔥品種，特別是雜交品種。洋蔥為異花授粉作物，花器官很小，難以開展常規人工雜交育種，國內對洋蔥雄性不育的研究起步比較晚，選育出的洋蔥雜交品種質量與國外品種存在一定差距，真正應用于市場的很少。利用洋蔥雄性不育系是進行雜交品種選育和制種的關鍵，大部分從事洋蔥育種的工作者都致力于洋蔥雄性不育系的選育。本研究旨在對田間觀察到的洋蔥不育植株，利用分子標記方法進行育性鑒定，確定其不育性及不育類型，然后通過組培擴繁不育系，為選育洋蔥雜交品種奠定基礎。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料概況

　　連蔥15號由連云港市農業科學院選育，中早熟品種，商品性好，外皮金黃色，內部鱗片白色，有甜味，球形指數0.85，假莖較細;單球重330 g，黃淮地區9月5～10日播種，11月初定值，次年5月上旬開始采收，產量5400～5900 kg/667 m2，抗病性強。

　　1.2 不育株的鑒定

　　1.2.1 田間鑒定 洋蔥開花期，在連蔥15號種植群體中尋找符合洋蔥不育株表觀特征的植株，將不育株選擇其中一個花球套袋自交(保證花球上沒有開放的小花)，觀察自交結實情況。

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　　1.2.2 分子標記鑒定

　　1.2.2.2 引物設計與合成 引物參考報道的orf725，由合成：

　　正向引物序列(5′-3′):

　　F1-CATAGGCGGGCTCACAGGAATA。

　　反向引物序列(5′-3′):

　　R1-AATCCTAGTGTCCGGGGTTTCT，

　　R2-CAGCGAACTTTCATTCTTTCGC。

　　1.2.2.3 PCR擴增 PCR擴增試劑購置于TAKARA公司，反應體系為25 μL，包括：2 μL DNA(0.1 μg)，2.5 μL 10×PCR buffer，1.25 μL(10 μmol/L)正向引物，1.25 μL(10 μmol/L)反向引物，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.25 μL TaqM和15.8 mL ddH2O，PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環;72 ℃延伸10 min[5]，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。

　　1.3 不育株組培擴繁

　　1.3.1 組培方法篩選 參照組培方法，加引用文獻利用同品種可育株，進行培養基配方的篩選，再應用于不育株的組培。

　　表1 培養基成分及配比

　　

 

　　注：MS為通用培養基代號，培養基pH為5.8，瓊脂8 g/L，蔗糖30 g/L。

　　1.3.2 組培苗倍性鑒定 將擴繁得到的洋蔥單株壯苗轉入生根培養基1/2MS+1 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA中進行培養，培養溫度為20～25 ℃。當組培苗根長至2～3 cm時，隨機選幾根生長健壯的根，取2～3 mm根尖制作壓片，在顯微鏡下觀察根尖染色體的有絲分裂情況。

　　1.3.3 組培苗生根、馴化移栽 洋蔥生根培養后，打開培養器皿的封口，放置1～2 d后，將洋蔥苗從培養器皿中取出，洗凈根部附著的培養基，移入裝有沙土的盆中，于自然光照條件下，白天22～25 ℃、夜間11～15 ℃的條件下培養，待洋蔥苗成活后移栽至大田。

　　2 結果與分析

　　2.1 洋蔥植株不育性鑒定結果

　　2.1.1 不育株表型鑒定 不育株剛開的花花藥顏色呈透明狀、顏色略帶綠色;開花后期與可育株相比，花藥干枯萎縮嚴重(圖1);用手觸碰花球，無花粉沾手。開花前套袋自交，成熟后經檢查完全不結實。

　　

 

　　圖1 洋蔥可育株與不育株花球對比

　　2.1.2 不育株分子鑒定 根報道，采用orf725標記進行PCR擴增，能夠在可育株中擴增出一條833 bp，T型不育中擴增出833 bp和628 bp兩條帶，S型不育中只能擴增出628 bp單一條帶。本試驗結果如圖2，CK為希望之星正?？捎?，A為希望之星不育株，3個CK都擴增出833 bp條帶，3個不育材料都擴增出833 bp和628 bp兩個條帶，可以確定田間觀察到的洋蔥為不育株，且是CMS-T型不育。

　　2.2 洋蔥不育株組織培養

　　采用鱗莖盤做外植體，采用MS培養基，配以一定比例的6-BA和NAA，不誘導愈傷組織，只誘導不定芽。由表2可知，每一種培養基都有超過70%的誘導率，采用M65、M74配方的培養基，誘導率達到了100%。比較平均每個鱗莖盤誘導不定芽數發現，該洋蔥品種在M74的培養基上平均每個鱗莖盤有3個不定芽，誘導效果明顯高于其他培養基。最終確定用M74，即MS+7 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA培養基進行不育株的擴繁。

　　

 

　　圖2 PCR擴增結果

　　表2 洋蔥在不同培養基上的增殖效果

　　

 

　　2.3 再生植株的倍性鑒定

　　將所獲得的不定芽從鱗莖盤切下，轉移至MS培養基中，7～10 d后發育成正常植株，再將該植株轉入1/2MS+1 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA培養基中生根，20 d左右生根，對所獲得的再生植株進行根尖染色體數分析，發現擴繁所得的洋蔥不育株含2n=2x=16條染色體(圖3)。

　　3 討論

　　利用雄性不育系配制雜種一代是蔬菜雜交優勢利用的主要育種途徑，洋蔥也是最早利用雄性不育系育種的蔬菜之一，但是由于洋蔥兩年生，3年1個世代，采用傳統育種方法選育洋蔥雄性不育系時間太長。國外對洋蔥雄性不育的研究較早較深入，目前中國市場上的洋蔥雜交品種也多從國外引進，我國缺乏具有自主知識產權的洋蔥雜交品種瓶頸在于洋蔥不育系的選育。國內外利用分子標記進行洋蔥雄性育性的相關研究已有不少報道，通過試驗比較，采用orf725標記，不僅能快速鑒定出洋蔥育性，還能區分出洋蔥不育類型，方法簡單實用而經濟。利用組培，能快速擴繁不育株，但是對于不同類型的洋蔥，不同配方的培養基，增殖效果不盡相同，本試驗條件下，連蔥15號以洋蔥鱗莖盤為外植體，含有7 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA的MS培養基增殖效果最好，通過染色體計數分析，洋蔥組培苗的倍性不變。分子標記與組織培養兩者有效結合，能快速培育出不育系，為雜交種的選育提供材料。

　　

 

　　圖3 再生洋蔥植株根尖細胞有絲分裂

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